Sequenziamento Sanger

Principi Fondamentali del Sequenziamento Sanger

Il sequenziamento Sanger, noto anche come metodo di terminazione della catena, è una tecnica consolidata per determinare la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA. Richiede un DNA stampo denaturato a singola elica, un primer specifico per iniziare la sintesi, DNA polimerasi per catalizzare l'aggiunta di nucleotidi e una miscela di deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs) e dideoxinucleotidi trifosfati (ddNTPs). I ddNTPs sono analoghi dei dNTPs, ma mancano del gruppo ossidrile 3’ necessario per formare il legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo, causando la terminazione della catena di DNA in crescita. La reazione avviene in un buffer con una concentrazione salina e ioni magnesio (Mg2+) ottimizzati per l'attività enzimatica. La presenza di ddNTPs marcatori in proporzioni controllate consente la generazione di una serie di frammenti di DNA terminati in modo specifico, che possono essere separati e analizzati per dedurre la sequenza del DNA stampo.

Sequenziamento Automatico e Rilevamento Fluorescente

Il sequenziamento automatico del DNA sfrutta la fluorescenza per rilevare i frammenti di DNA terminati da ddNTPs. In questa tecnica, ogni tipo di ddNTP è coniugato a un diverso fluorocromo, che emette luce a una lunghezza d'onda caratteristica quando eccitato. Nonostante tutti i fluorocromi assorbano alla stessa lunghezza d'onda, emettono a lunghezze d'onda diverse, permettendo la distinzione tra i quattro diversi ddNTPs. Ogni fluorocromo è composto da un gruppo donatore che assorbe la luce e trasferisce l'energia a un gruppo accettore che emette la luce, con un linker che li connette. L'analisi dei frammenti di DNA terminati da ddNTPs fluorescenti permette di determinare la sequenza del DNA stampo, con il colore emesso che identifica il nucleotide terminatore e la lunghezza del frammento che indica la sua posizione nella sequenza.