Sequenziamento Sanger

Principi Fondamentali del Sequenziamento Sanger

Il sequenziamento Sanger, noto anche come metodo di terminazione della catena, è una tecnica consolidata per determinare la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA. Richiede un DNA stampo denaturato a singola elica, un primer specifico per iniziare la sintesi, DNA polimerasi per catalizzare l'aggiunta di nucleotidi e una miscela di deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs) e dideoxinucleotidi trifosfati (ddNTPs). I ddNTPs sono analoghi dei dNTPs, ma mancano del gruppo ossidrile 3’ necessario per formare il legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo, causando la terminazione della catena di DNA in crescita. La reazione avviene in un buffer con una concentrazione salina e ioni magnesio (Mg2+) ottimizzati per l'attività enzimatica. La presenza di ddNTPs marcatori in proporzioni controllate consente la generazione di una serie di frammenti di DNA terminati in modo specifico, che possono essere separati e analizzati per dedurre la sequenza del DNA stampo.

Sequenziamento Automatico e Rilevamento Fluorescente

Il sequenziamento automatico del DNA sfrutta la fluorescenza per rilevare i frammenti di DNA terminati da ddNTPs. In questa tecnica, ogni tipo di ddNTP è coniugato a un diverso fluorocromo, che emette luce a una lunghezza d'onda caratteristica quando eccitato. Nonostante tutti i fluorocromi assorbano alla stessa lunghezza d'onda, emettono a lunghezze d'onda diverse, permettendo la distinzione tra i quattro diversi ddNTPs. Ogni fluorocromo è composto da un gruppo donatore che assorbe la luce e trasferisce l'energia a un gruppo accettore che emette la luce, con un linker che li connette. L'analisi dei frammenti di DNA terminati da ddNTPs fluorescenti permette di determinare la sequenza del DNA stampo, con il colore emesso che identifica il nucleotide terminatore e la lunghezza del frammento che indica la sua posizione nella sequenza.

Il Processo di Sequenziamento Sanger Passo per Passo

Il processo di sequenziamento Sanger inizia con l'annessione di un primer al DNA stampo, seguito dall'aggiunta sequenziale di nucleotidi da parte della DNA polimerasi in direzione 5’->3’. La reazione di sequenziamento contiene sia dNTPs normali che ddNTPs marcatori, con un rapporto che permette l'incorporazione casuale di ddNTPs. Quando un ddNTP viene incorporato, la sintesi del DNA termina, risultando in una collezione di frammenti di DNA di lunghezze variabili, ciascuno terminante con un ddNTP specifico. Questi frammenti vengono poi separati per dimensione attraverso elettroforesi capillare, con i frammenti più corti che migrano più velocemente. La sequenza del DNA stampo viene dedotta analizzando l'ordine dei frammenti terminati da ddNTPs.

Sequenziamento Capillare e Interpretazione dell'Elettroferogramma

Nel sequenziamento capillare, i frammenti di DNA terminati da ddNTPs fluorescenti vengono separati in capillari sottili riempiti con un polimero viscoso. Un laser eccita i fluorocromi mentre i frammenti passano attraverso una finestra di rilevamento, e la luce emessa viene rilevata da un sensore. Questi segnali vengono convertiti in un elettroferogramma, un grafico che rappresenta la sequenza di picchi corrispondenti ai diversi frammenti di DNA. L'elettroferogramma permette di identificare le differenze alleliche e di rilevare l'eterozigosi in un locus specifico, fornendo un profilo dettagliato della sequenza nucleotidica.

Purificazione del Prodotto della PCR Pre-Sequenziamento

Prima del sequenziamento, è cruciale purificare il prodotto della reazione a catena della polimerasi (PCR) per eliminare i primers in eccesso, i dNTPs non incorporati e altri componenti che potrebbero interferire con la reazione di sequenziamento. Questo può essere realizzato attraverso metodi di purificazione enzimatica, che utilizzano esonucleasi e fosfatasi per degradare i primers e i dNTPs residui, o attraverso metodi fisici come la purificazione su colonna o su gel, che separano le molecole in base alla loro dimensione e forma. Questi passaggi di purificazione sono fondamentali per assicurare che la reazione di sequenziamento proceda in modo efficiente e accurato.

Applicazioni Cliniche e di Ricerca del Sequenziamento Sanger

Il sequenziamento Sanger è ampiamente utilizzato in ambito clinico e di ricerca per identificare mutazioni genetiche, confermare diagnosi, identificare portatori asintomatici di malattie ereditarie e studiare la variabilità genetica. È particolarmente utile per l'analisi di mutazioni puntiformi, piccole inserzioni o delezioni che possono influenzare la funzione genica. Ad esempio, in una famiglia con una storia di malattie ereditarie recessive, il sequenziamento Sanger può determinare se i genitori sono portatori sani del gene mutato. Questa tecnica è anche impiegata per caratterizzare varianti genetiche che possono avere implicazioni nella risposta ai farmaci o nella suscettibilità a malattie.