Mapa conceptual y resúmen PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Mapa conceptual
Las técnicas de purificación de ácidos nucleicos, como la precipitación con solventes orgánicos y sales, cromatografía de intercambio iónico y esferas magnéticas, son cruciales en biotecnología. Estos métodos eliminan contaminantes y permiten obtener muestras puras de ADN, ARN y plásmidos, esenciales para la investigación científica y la producción de proteínas recombinantes. La purificación de ARN requiere cuidados especiales para evitar la degradación por ARNasas.
Resumen
Esquema
Fundamentos de la Purificación de Ácidos Nucleicos
La purificación de ácidos nucleicos es un proceso esencial en la biotecnología y la investigación biomédica que consiste en aislar ADN o ARN de alta pureza a partir de muestras biológicas. Este proceso requiere la eliminación de contaminantes como proteínas, lípidos, polisacáridos y sales. Se utilizan diversas técnicas, como la extracción con fenol-cloroformo, la precipitación con etanol o isopropanol, y métodos basados en columnas de afinidad, que explotan las propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos para su separación. La elección del método depende del tipo de muestra, la cantidad de material y la aplicación final del ácido nucleico purificado.Técnicas de Precipitación en la Purificación de Ácidos Nucleicos
La precipitación de ácidos nucleicos es un método comúnmente utilizado que se basa en la disminución de la solubilidad de estas moléculas en presencia de altas concentraciones de sales y alcoholes. En la técnica de salting-out, se añade una solución salina concentrada al lisado celular para precipitar proteínas, dejando los ácidos nucleicos en el sobrenadante. Luego, se añade etanol o isopropanol para precipitar el ADN o ARN, que se recoge por centrifugación, se lava para eliminar residuos y se resuspende en un tampón adecuado. Esta técnica es eficiente para procesar grandes volúmenes y es fundamental para obtener ácidos nucleicos libres de contaminantes.Cromatografía de Intercambio Iónico para la Purificación Selectiva
La cromatografía de intercambio iónico es una técnica de purificación que separa las moléculas basándose en diferencias en sus cargas eléctricas. Los ácidos nucleicos, que son polianiones debido a sus grupos fosfato, se unen a resinas de intercambio iónico cargadas positivamente. La elución se realiza incrementando la concentración de sales o cambiando el pH del tampón. Esta técnica es altamente selectiva y se puede ajustar para purificar distintos tipos de ácidos nucleicos, proporcionando una herramienta poderosa para la separación de moléculas con cargas similares.Purificación Mediante Esferas Magnéticas y su Aplicación en ARNm
La purificación de ácidos nucleicos mediante esferas magnéticas es una técnica que utiliza partículas recubiertas con materiales que se unen específicamente a los ácidos nucleicos. En el caso del ARNm, las esferas pueden estar recubiertas con oligonucleótidos que se hibridan con la cola poli-A presente en estos mensajeros eucariotas. La aplicación de un campo magnético permite la separación rápida y eficiente del ARNm, que se libera posteriormente en condiciones adecuadas. Esta técnica es altamente específica y minimiza la manipulación de la muestra, reduciendo el riesgo de degradación.Estrategias Específicas para la Purificación de ARN
La purificación de ARN requiere estrategias que prevengan su degradación por ribonucleasas. Se utilizan métodos como la ultrafiltración y la centrifugación en gradiente de densidad, que separan las moléculas basándose en su tamaño y densidad, respectivamente. Además, es crucial trabajar en un ambiente libre de ARNasas, utilizando cabinas de flujo laminar, guantes libres de polvo y superficies tratadas con sustancias que inactivan las ARNasas. Estas medidas son esenciales para mantener la integridad del ARN durante la purificación y asegurar la calidad de la muestra para su uso en aplicaciones posteriores.Métodos de Purificación de Plásmidos en Biotecnología
La purificación de plásmidos es un paso clave en la clonación y expresión de genes. Métodos como la lisis alcalina y la centrifugación en gradiente de cesio-cloruro permiten separar plásmidos del ADN genómico y otros componentes celulares. Estos métodos se basan en la habilidad de los plásmidos para renaturalizarse tras la desnaturalización y en su menor densidad comparada con el ADN genómico. Para evitar la degradación de los plásmidos, se deben tomar precauciones similares a las empleadas en la purificación de ARN, garantizando así la obtención de plásmidos intactos y funcionales para su uso en biotecnología.
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1. PURIFICACIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS
ELIMINACIÓN DE COMPUESTOS SOLUBLES EN SOLVENTES ORGÁNICOS
LOS SOLVENTES ORGÁNICOS SE UTILIZAN PARA SEPARAR LOS ÁCIDOS NUCLEICOS DE OTROS COMPONENTES DEL LISADO
PRECIPITACIÓN DEL ADN
LAVADO DE ADN
EL ADN SE LAVA CON ETANOL PARA ELIMINAR CONTAMINANTES SOLUBLES
RESUSPENSIÓN DEL ADN
EL ADN SE RESUSPENDE EN AGUA DESTILADA O TAMPÓN DE BAJA SALINIDAD PARA ELIMINAR EL ETANOL
REHIDRATACIÓN
EL ADN SE REHIDRATA LENTAMENTE PARA EVITAR DAÑOS EN LA MOLÉCULA
2. PRECIPITACIÓN CON SALES (SALTING-OUT)
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
LAS PROTEÍNAS SE PRECIPITAN EN PRESENCIA DE ALTAS CONCENTRACIONES SALINAS
PRECIPITACIÓN DEL ADN
EL ADN SE PRECIPITA CON ETANOL DESPUÉS DE ELIMINAR LAS PROTEÍNAS
LAVADO Y RESUSPENSIÓN DEL ADN
EL ADN SE LAVA CON ETANOL Y SE RESUSPENDE EN AGUA DESTILADA O TAMPÓN DE BAJA SALINIDAD
3. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
INTERCAMBIADOR ANIÓNICO
LOS GRUPOS FUNCIONALES DE LA FASE ESTACIONARIA TIENEN CARGA POSITIVA PARA UNIR LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
FASE ESTACIONARIA UTILIZADA
SE UTILIZAN MATRICES DE SÍLICE CON GRUPOS FUNCIONALES MAE O DEAE PARA UNIR LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
PROCEDIMIENTO
LOS ÁCIDOS NUCLEICOS SE UNEN A LOS GRUPOS FUNCIONALES DEL INTERCAMBIADOR Y SE ELUYEN CON UN TAMPÓN DE ALTA SALINIDAD Y PH
4. PURIFICACIÓN MEDIANTE ESFERAS MAGNÉTICAS
ADSORCIÓN A LAS ESFERAS MAGNÉTICAS
LOS ÁCIDOS NUCLEICOS SE UNEN A LAS MICROESFERAS RECUBIERTAS DE SÍLICE EN PRESENCIA DE UN AGENTE CAOTRÓPICO
SEPARACIÓN MAGNÉTICA POR AFINIDAD
LAS MICROESFERAS RECUBIERTAS CON POLÍMEROS ESPECÍFICOS SE UTILIZAN PARA PURIFICAR ÁCIDOS NUCLEICOS ESPECÍFICOS
PROCEDIMIENTO
LAS MICROESFERAS SE AÑADEN AL LISADO Y SE SEPARAN CON UN IMÁN DESPUÉS DE LAVAR CON ETANOL
5. PURIFICACIÓN DE ARN
LAVADO DE ESFERAS CON ETANOL
SE UTILIZA ETANOL PARA LIMPIAR LAS ESFERAS Y ELIMINAR CONTAMINANTES
ELUCIÓN DEL ARN
SEPARACIÓN DEL ARN DEL OLIGO-T
SE ELEVA LA TEMPERATURA PARA SEPARAR EL ARN DEL OLIGO-T MEDIANTE DESNATURALIZACIÓN TÉRMICA
TRANSFERENCIA DEL ARN A UN TUBO LIMPIO
UNA VEZ SEPARADO, EL ARN SE TRANSFIERE A UN TUBO LIMPIO
ULTRAFILTRACIÓN
SE UTILIZA UNA MEMBRANA PARA RETENER LOS PRODUCTOS DE PCR Y LUEGO SE LAVAN CON ETANOL PARA ELIMINAR CONTAMINANTES
6. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE
SE UTILIZA LA DIFERENCIA DE DENSIDAD PARA SEPARAR LOS PLÁSMIDOS DEL ADN CROMOSÓMICO BACTERIANO
LISIS ALCALINA
NEUTRALIZACIÓN RÁPIDA
SE AÑADE UN PH ÁCIDO PARA REASOCIAR EL ADN PLASMÍDICO Y PRECIPITAR EL ADN CROMOSÓMICO Y LAS PROTEÍNAS
PURIFICACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO
SE UTILIZA ARNASAS PARA ELIMINAR EL ARN Y LUEGO SE PURIFICA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
7. CONSIDERACIONES ESPECIALES PARA LA PURIFICACIÓN DE ARN
SENSIBILIDAD DEL ARN A LAS ARNASAS
EL ARN ES MUY SENSIBLE A LAS ARNASAS, POR LO QUE SE DEBEN TOMAR PRECAUCIONES COMO USAR GUANTES Y LIMPIAR CON INACTIVADORES DE ARNASAS
REQUISITOS PARA LA PURIFICACIÓN DE ARN
SE DEBEN UTILIZAR REACTIVOS Y MATERIALES LIBRES DE ARNASAS PARA EVITAR SU DEGRADACIÓN DURANTE EL PROCESO DE PURIFICACIÓN
PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
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00
Proceso de purificación de ácidos nucleicos
Eliminación de proteínas, sales y otros contaminantes para obtener ácidos nucleicos puros.
01
Técnica de purificación con solventes orgánicos
Uso de la solubilidad diferencial en solventes para separar ADN de otros componentes celulares.
02
Pasos de la técnica de purificación
Incluye eliminación de solubles, precipitación de ADN, lavado y resuspensión.
