Fundamentos de la Espectrofotometría UV-Visible
Mapa conceptual
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que determina la concentración de compuestos en solución a través de la luz absorbida. Se basa en la absorción molecular y la relación entre la absorbancia y la concentración del analito. La ley de Lambert-Beer es fundamental en este proceso, aunque tiene limitaciones. Los espectrofotómetros son clave en la medición precisa, afectada por factores como el pH y la temperatura.
Resumen
Esquema
Fundamentos de la Espectrofotometría UV-Visible
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica fundamental que permite determinar la concentración de compuestos en solución mediante la medición de la luz absorbida a distintas longitudes de onda. Se basa en el principio de que las moléculas absorben radiación electromagnética en las regiones ultravioleta (UV) y visible del espectro, con una relación directamente proporcional entre la cantidad de luz absorbida y la concentración del analito. Los espectrofotómetros, los instrumentos utilizados en esta técnica, permiten seleccionar la longitud de onda adecuada y medir la intensidad de la luz que la muestra ha absorbido. Esta técnica es de gran utilidad en campos como la bioquímica, donde se emplea para identificar y cuantificar biomoléculas, a menudo utilizando reactivos que reaccionan con el compuesto de interés para formar un complejo coloreado que se puede detectar incluso en matrices complejas.Principios de Absorción Molecular y Espectro de Absorción
Las moléculas pueden absorber energía luminosa, lo que resulta en la transición de electrones de un estado energético basal a un estado excitado. La cantidad de energía absorbida es igual a la diferencia de energía entre estos estados y es específica para cada tipo de molécula, generando un espectro de absorción único. Este espectro actúa como una huella digital que permite la identificación de compuestos específicos. La espectrofotometría abarca tanto la región ultravioleta (UV), que se extiende de 100 a 400 nm, como la región visible del espectro, que va de 400 a 700 nm, permitiendo el análisis de una amplia gama de sustancias.Transmitancia y Absorbancia en la Espectrofotometría
La transmitancia (T) se define como la fracción de la intensidad de la luz incidente (Io) que logra pasar a través de la muestra (It), y se expresa generalmente como un porcentaje. En contraste, la absorbancia (A) es una medida de la luz que ha sido absorbida por la muestra y se calcula como el logaritmo base diez negativo de la transmitancia. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración del cromóforo, que es la parte de la molécula responsable de la absorción de luz, y a la longitud del camino óptico de la muestra, proporcionando una medida cuantitativa de la interacción entre la luz y la muestra.Ley de Lambert-Beer y su Aplicación
La ley de Lambert-Beer establece una relación lineal entre la absorbancia y la concentración de un cromóforo en solución, formulada como A = εlc, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción molar, l es la longitud del camino óptico y c es la concentración del cromóforo. Esta relación es aplicable en condiciones ideales para soluciones diluidas y transparentes. Sin embargo, la ley tiene limitaciones y puede no ser válida en situaciones donde hay interacciones entre las moléculas, dispersión de luz, o cambios en el índice de refracción del medio, lo que requiere consideraciones adicionales o métodos de corrección para obtener resultados precisos.Instrumentación en Espectrofotometría UV-Visible
Los espectrofotómetros UV-visible son instrumentos complejos que constan de una fuente de luz que emite un espectro amplio de longitudes de onda, un monocromador que selecciona la longitud de onda deseada, un compartimento para colocar la muestra, un detector sensible a la luz y un sistema para procesar y mostrar los datos. La medición comienza con la calibración del instrumento utilizando una solución de referencia o un blanco, para luego proceder con la medición de la muestra y determinar su absorbancia. La precisión y exactitud de las mediciones dependen de la calidad del instrumento y de la correcta calibración y manejo del mismo.Obtención y Análisis de Espectros de Absorción
Un espectro de absorción es un gráfico que representa la absorbancia de un compuesto en función de las longitudes de onda. Se obtiene al medir la absorbancia de una solución diluida en comparación con un blanco, y revela la longitud de onda de máxima absorción (λmax) del compuesto. El λmax es esencial para la identificación cualitativa y la cuantificación precisa de sustancias. Factores como el pH, la temperatura y la polaridad del solvente pueden modificar el espectro de absorción, afectando tanto el λmax como el coeficiente de extinción molar (ε), lo que debe ser considerado en el análisis espectrofotométrico para garantizar la exactitud de los resultados.
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Espectrofotometría UV-visible
Técnica analítica
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de compuestos en solución mediante la medición de la luz absorbida a distintas longitudes de onda
Principios de Absorción Molecular y Espectro de Absorción
Absorción de energía luminosa
Las moléculas pueden absorber energía luminosa, lo que resulta en la transición de electrones de un estado energético basal a un estado excitado
Espectro de absorción
El espectro de absorción es una huella digital que permite la identificación de compuestos específicos
Transmitancia y Absorbancia en la Espectrofotometría
La transmitancia y la absorbancia son medidas utilizadas en la espectrofotometría para cuantificar la interacción entre la luz y la muestra
Ley de Lambert-Beer y su Aplicación
Relación entre absorbancia y concentración
La ley de Lambert-Beer establece una relación lineal entre la absorbancia y la concentración de un cromóforo en solución
Limitaciones de la ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer puede no ser válida en situaciones donde hay interacciones entre las moléculas, dispersión de luz, o cambios en el índice de refracción del medio
Instrumentación en Espectrofotometría UV-Visible
Componentes de un espectrofotómetro
Los espectrofotómetros constan de una fuente de luz, un monocromador, un compartimento para la muestra, un detector y un sistema de procesamiento de datos
Calibración y manejo del instrumento
La precisión y exactitud de las mediciones en espectrofotometría dependen de la calidad del instrumento y de su correcta calibración y manejo
Obtención y Análisis de Espectros de Absorción
Obtención de un espectro de absorción
Un espectro de absorción se obtiene al medir la absorbancia de una solución diluida en comparación con un blanco
Factores que afectan el espectro de absorción
El pH, la temperatura y la polaridad del solvente pueden modificar el espectro de absorción, afectando tanto el λmax como el coeficiente de extinción molar (ε)
Fundamentos de la Espectrofotometría UV-Visible
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Principio de absorción de luz en espectrofotometría UV-visible
Moléculas absorben luz en regiones UV y visible, proporcional a concentración del analito.
01
Función de los espectrofotómetros
Seleccionar longitud de onda y medir intensidad de luz absorbida por la muestra.
02
Aplicación en bioquímica
Identificar y cuantificar biomoléculas, uso de reactivos para detección en matrices complejas.
