La espectrofotometría de fluorescencia es una técnica analítica basada en la emisión de luz por moléculas excitadas. Se detallan los principios de la técnica, incluyendo los estados energéticos singulete y triplete, y los mecanismos de desactivación como la fluorescencia y fosforescencia. Se aborda la importancia del rendimiento cuántico y los factores que influyen en la intensidad de la fluorescencia. Además, se describe la instrumentación específica y el uso de marcadores fluorescentes en el análisis cuantitativo.
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Las moléculas excitadas por una fuente de energía emiten luz al retornar a su estado fundamental
Momento angular orbital
El movimiento angular del electrón alrededor del núcleo se conoce como momento angular orbital
Momento angular de spin
El giro del electrón sobre su propio eje se conoce como momento angular de spin
La orientación de los spines de los electrones determina la multiplicidad de los niveles de energía de un átomo o molécula
Relajación vibracional
La disipación de energía no radiativa mediante la vibración de las moléculas es un mecanismo de desactivación
Conversión interna
La conversión de energía en calor es un mecanismo de desactivación no radiativo
Cruce intersistémico
La transición entre estados de diferente multiplicidad sin emisión de luz es un mecanismo de desactivación no radiativo
Fluorescencia
La emisión de luz por parte de una molécula al retornar a su estado fundamental es un mecanismo de desactivación radiativo
Fosforescencia
La emisión de luz después de un retardo significativo por parte de una molécula en estado triplete es un mecanismo de desactivación radiativo
El diagrama de Jablonski muestra los niveles de energía y las transiciones que ocurren durante la fluorescencia y fosforescencia
La emisión de fluorescencia ocurre cuando las moléculas regresan al estado fundamental después de la relajación vibracional
La fosforescencia es un proceso más lento que la fluorescencia debido a la prohibición de transiciones entre estados de diferente multiplicidad, y existen otros mecanismos de desactivación como la conversión interna y el cruce intersistémico
El espectrofluorímetro utiliza una fuente de luz, monocromadores y un detector para medir la fluorescencia de las muestras
El rendimiento cuántico de la fluorescencia es una medida de la eficiencia con la que una molécula emite fotones en relación con los que absorbe
La concentración de una sustancia fluorescente en una muestra puede determinarse mediante una curva de calibración construida con soluciones patrón de concentraciones conocidas
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Emisión de luz en moléculas
Moléculas excitadas por luz UV/visible emiten fotón al volver a estado fundamental.
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Momento angular orbital y de spin
Orbital: movimiento del electrón alrededor del núcleo. Spin: giro del electrón sobre su eje.
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Multiplicidad y estados energéticos
Multiplicidad determina tipo de estado energético: singulete (spines apareados, multiplicidad 1), triplete (spines paralelos, multiplicidad 3).
