Espectrofotometría de fluorescencia

Principios de la Espectrofotometría de Fluorescencia

La espectrofotometría de fluorescencia es una técnica analítica que se fundamenta en la emisión de luz por parte de moléculas que, al ser excitadas por una fuente de energía, como la luz ultravioleta o visible, retornan a su estado fundamental liberando un fotón. Este fenómeno implica la comprensión de conceptos como el momento angular orbital, que es el movimiento angular del electrón alrededor del núcleo, y el momento angular de spin, que resulta del giro del electrón sobre su propio eje. Los electrones pueden tener dos orientaciones de spin, +1/2 o -1/2, y la suma de estos valores determina la multiplicidad de los niveles de energía de un átomo o molécula, que a su vez indica el tipo de estado energético según la orientación de los spines. Un estado singulete se caracteriza por tener todos los spines apareados y una multiplicidad de 1, mientras que un estado triplete tiene un par de electrones con spines paralelos y una multiplicidad de 3.

Mecanismos de Desactivación y Estados Energéticos

Los mecanismos de desactivación son rutas por las cuales las moléculas regresan a su estado fundamental tras haber sido excitadas. Estos mecanismos pueden ser no radiativos, como la relajación vibracional, la conversión interna y el cruce intersistémico, o radiativos, como la fluorescencia y la fosforescencia. En el estado fundamental, los electrones se encuentran apareados de acuerdo con el principio de exclusión de Pauli. Cuando las moléculas absorben energía, pueden alcanzar estados excitados singuletes o tripletes, con spines apareados o no respectivamente. La fluorescencia se produce cuando una molécula retorna de un estado vibracional excitado a un estado vibracional del estado fundamental, emitiendo un fotón. La fosforescencia, por otro lado, ocurre cuando la transición involucra un estado triplete excitado y es un proceso más lento que la fluorescencia debido a la prohibición de transiciones entre estados de diferente multiplicidad.

Diagrama de Jablonski y Procesos de Desactivación

El diagrama de Jablonski es una representación esquemática que muestra los niveles de energía vibracionales y electrónicos y las transiciones que ocurren durante la fluorescencia y fosforescencia. Las moléculas en el estado fundamental absorben energía y se excitan a niveles vibracionales superiores dentro de un estado electrónico excitado. Mediante la relajación vibracional, las moléculas disipan energía no radiativa hasta alcanzar el nivel vibracional más bajo del estado excitado. La emisión de fluorescencia ocurre cuando las moléculas regresan al estado fundamental. La fosforescencia se da cuando las moléculas en el estado triplete excitado regresan al estado fundamental emitiendo luz después de un retardo significativo. La conversión interna y el cruce intersistémico son otros mecanismos de desactivación que implican transiciones entre estados de igual o diferente multiplicidad, respectivamente, sin emisión de luz.

Rendimiento Cuántico y Factores que Afectan la Fluorescencia

El rendimiento cuántico de la fluorescencia es una medida de la eficiencia con la que una molécula emite fotones en relación con los fotones que absorbe y se calcula como la razón entre el número de fotones emitidos y el número de fotones absorbidos. Factores como la estructura molecular, la rigidez estructural y la presencia de iones metálicos pueden afectar la intensidad de la fluorescencia. Compuestos con sistemas de anillos aromáticos y transiciones electrónicas permitidas, como las transiciones Π→Π*, suelen exhibir altos rendimientos cuánticos. La rigidez estructural puede reducir la pérdida de energía por procesos no radiativos, incrementando así la eficiencia de la fluorescencia.

Instrumentación en Espectrofluorimetría

El espectrofluorímetro es el equipo utilizado para medir la fluorescencia de las muestras. Este instrumento consta de una fuente de luz ultravioleta o visible, monocromadores para seleccionar las longitudes de onda de excitación y emisión, y un detector sensible a la luz, como el fotomultiplicador. La muestra absorbe luz a una longitud de onda específica y emite luz a otra longitud de onda. La luz emitida se recoge en un ángulo de 90 grados respecto a la fuente de luz para minimizar la detección de luz dispersa. Se emplea un factor de corrección para ajustar la señal detectada y compensar la radiación que no es recogida por el monocromador de emisión.

Análisis Cuantitativo y Marcadores Fluorescentes

El análisis cuantitativo mediante espectrofotometría de fluorescencia se basa en la relación proporcional entre la intensidad de la fluorescencia y la concentración de la sustancia fluorescente en la muestra. Para determinar la concentración de una sustancia desconocida, se construye una curva de calibración utilizando soluciones patrón de concentraciones conocidas. Los marcadores fluorescentes son compuestos que se unen específicamente a moléculas no fluorescentes para facilitar su detección y cuantificación. Estos marcadores deben ser altamente específicos, estables, no tóxicos y ofrecer una señal clara y cuantificable, siendo una alternativa a los métodos de marcaje con isótopos radiactivos.