Técnicas de Hibridación In Situ (ISH)
Mapa conceptual
Las técnicas de hibridación in situ, como FISH y CISH, son métodos moleculares para detectar secuencias de ADN y ARN en células y tejidos. Permiten la observación de secuencias genéticas en su contexto natural, facilitando el diagnóstico y la investigación genética. Estas técnicas se aplican a muestras frescas, congeladas o fijadas, y son esenciales para identificar alteraciones cromosómicas y estudios retrospectivos.
Resumen
Esquema
Técnicas de Hibridación In Situ (ISH)
Las técnicas de hibridación in situ (ISH) constituyen un conjunto de métodos moleculares esenciales para la detección y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos, tanto ADN como ARN, en preparaciones de cromosomas durante la metafase, así como en células y tejidos. Estas técnicas se distinguen por su capacidad de realizar la hibridación directamente en preparaciones citológicas o cortes de tejido, lo que permite la observación de las secuencias de interés en el contexto de la estructura celular y tisular. La ISH es ventajosa porque no requiere la extracción previa de ácidos nucleicos, es relativamente rápida, sencilla y de coste moderado. Se puede aplicar a muestras frescas, congeladas o fijadas en formol e incluidas en parafina, ofreciendo la posibilidad de realizar estudios retrospectivos. Utiliza sondas marcadas con etiquetas no radiactivas, que pueden ser de ADN, ARN o ácidos nucleicos peptídicos (PNA), proporcionando así una herramienta valiosa para la investigación y el diagnóstico.Tipos de Muestras y Preparaciones para ISH
La expresión "in situ" refleja que la secuencia de ácidos nucleicos objetivo se localiza en su entorno fisiológico natural, ya sea en cromosomas durante la metafase o en núcleos interfásicos para el ADN, y en el citoplasma para el ARN. Para realizar la ISH, es necesario preparar las muestras biológicas en monocapa sobre un portaobjetos de cristal. Las preparaciones de cromosomas en metafase se obtienen de cultivos celulares interrumpiendo las mitosis en metafase con colchicina. Los núcleos interfásicos desnudos se preparan mediante un proceso que incluye un choque hipotónico seguido de fijación y extensión sobre el portaobjetos. Las extensiones citológicas provienen de fluidos biológicos y se extienden sobre portaobjetos para su análisis. Las secciones de tejido, por su parte, pueden ser de muestras frescas congeladas o de muestras fijadas en formol e incluidas en parafina, lo que permite una amplia gama de aplicaciones diagnósticas y de investigación.Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) y Cromogénica (CISH)
La ISH se divide en dos variantes principales: la hibridación in situ fluorescente (FISH) y la hibridación in situ cromogénica (CISH). La FISH utiliza sondas marcadas con fluorocromos que se detectan mediante microscopía de fluorescencia, siendo particularmente útil para identificar alteraciones cromosómicas como monosomías, trisomías, translocaciones y otras anomalías genéticas. Esta técnica es un complemento valioso para los métodos citogenéticos convencionales, ya que proporciona información detallada en casos de cariotipos normales o complejos. Por otro lado, la CISH emplea sondas marcadas con enzimas que catalizan la formación de un precipitado de color visible bajo microscopía de luz convencional, lo que facilita la observación de las secuencias objetivo sin la necesidad de equipamiento especializado para la detección de fluorescencia.Protocolo Genérico para la Realización de FISH
El protocolo estándar para la realización de FISH incluye varias etapas clave: hibridación, lavados de poshibridación, contratinción y visualización. Durante la hibridación, la sonda marcada se aplica sobre la muestra y se desnaturaliza el ADN para facilitar la unión de la sonda a su secuencia complementaria. Después de la incubación, se realizan lavados para eliminar el exceso de sonda y se procede a la contratinción, comúnmente con diamidino-2-fenilindol (DAPI), que tiñe los núcleos de un color azul visible bajo luz ultravioleta. La visualización se efectúa con un microscopio de fluorescencia, donde las secuencias diana marcadas se identifican en contraste con los cromosomas o núcleos teñidos. La interpretación de los resultados se basa en el tipo de sonda utilizada y la naturaleza de la alteración cromosómica que se investiga, proporcionando información crítica para el diagnóstico y la investigación genética.
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Definición de ISH
Métodos moleculares para la detección y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos
Las técnicas de hibridación in situ (ISH) son métodos moleculares que permiten detectar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en células y tejidos
Ventajas de la ISH
La ISH es ventajosa porque no requiere la extracción previa de ácidos nucleicos, es rápida, sencilla y de coste moderado, y se puede aplicar a muestras frescas, congeladas o fijadas en formol e incluidas en parafina
Tipos de muestras y preparaciones para ISH
La ISH puede realizarse en cromosomas durante la metafase, núcleos interfásicos, extensiones citológicas y secciones de tejido, lo que permite una amplia gama de aplicaciones diagnósticas e investigativas
Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) y Cromogénica (CISH)
Diferencias entre FISH y CISH
La FISH utiliza sondas marcadas con fluorocromos y se detecta mediante microscopía de fluorescencia, mientras que la CISH utiliza sondas marcadas con enzimas y se detecta mediante microscopía de luz convencional
Utilidad de FISH y CISH
La FISH es útil para identificar alteraciones cromosómicas, mientras que la CISH es útil para observar secuencias objetivo sin la necesidad de equipamiento especializado
Complementariedad con métodos citogenéticos convencionales
Tanto FISH como CISH son complementarios a los métodos citogenéticos convencionales, proporcionando información detallada en casos de cariotipos normales o complejos
Protocolo Genérico para la Realización de FISH
Etapas del protocolo
El protocolo estándar para la realización de FISH incluye hibridación, lavados de poshibridación, contratinción y visualización
Descripción de cada etapa
Durante la hibridación, se aplica una sonda marcada sobre la muestra y se desnaturaliza el ADN para facilitar la unión de la sonda a su secuencia complementaria, seguido de lavados para eliminar el exceso de sonda y contratinción con DAPI para teñir los núcleos. Finalmente, se visualiza la muestra con un microscopio de fluorescencia
Interpretación de los resultados
La interpretación de los resultados de FISH se basa en el tipo de sonda utilizada y la naturaleza de la alteración cromosómica investigada, proporcionando información crítica para el diagnóstico y la investigación genética
Técnicas de Hibridación In Situ (ISH)
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Las técnicas de ______ in situ son métodos para detectar y ubicar secuencias de ácidos nucleicos en preparaciones de ______ y otros.
hibridación
cromosomas
01
La hibridación in situ permite observar secuencias de interés sin necesidad de extraer previamente los ______ ______.
ácidos
nucleicos
02
La ISH se puede utilizar en muestras ______, ______ o fijadas en formol e incluidas en parafina.
frescas
congeladas
