Técnicas de Hibridación In Situ (ISH)

Técnicas de Hibridación In Situ (ISH)

Las técnicas de hibridación in situ (ISH) constituyen un conjunto de métodos moleculares esenciales para la detección y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos, tanto ADN como ARN, en preparaciones de cromosomas durante la metafase, así como en células y tejidos. Estas técnicas se distinguen por su capacidad de realizar la hibridación directamente en preparaciones citológicas o cortes de tejido, lo que permite la observación de las secuencias de interés en el contexto de la estructura celular y tisular. La ISH es ventajosa porque no requiere la extracción previa de ácidos nucleicos, es relativamente rápida, sencilla y de coste moderado. Se puede aplicar a muestras frescas, congeladas o fijadas en formol e incluidas en parafina, ofreciendo la posibilidad de realizar estudios retrospectivos. Utiliza sondas marcadas con etiquetas no radiactivas, que pueden ser de ADN, ARN o ácidos nucleicos peptídicos (PNA), proporcionando así una herramienta valiosa para la investigación y el diagnóstico.

Tipos de Muestras y Preparaciones para ISH

La expresión "in situ" refleja que la secuencia de ácidos nucleicos objetivo se localiza en su entorno fisiológico natural, ya sea en cromosomas durante la metafase o en núcleos interfásicos para el ADN, y en el citoplasma para el ARN. Para realizar la ISH, es necesario preparar las muestras biológicas en monocapa sobre un portaobjetos de cristal. Las preparaciones de cromosomas en metafase se obtienen de cultivos celulares interrumpiendo las mitosis en metafase con colchicina. Los núcleos interfásicos desnudos se preparan mediante un proceso que incluye un choque hipotónico seguido de fijación y extensión sobre el portaobjetos. Las extensiones citológicas provienen de fluidos biológicos y se extienden sobre portaobjetos para su análisis. Las secciones de tejido, por su parte, pueden ser de muestras frescas congeladas o de muestras fijadas en formol e incluidas en parafina, lo que permite una amplia gama de aplicaciones diagnósticas y de investigación.

Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) y Cromogénica (CISH)

La ISH se divide en dos variantes principales: la hibridación in situ fluorescente (FISH) y la hibridación in situ cromogénica (CISH). La FISH utiliza sondas marcadas con fluorocromos que se detectan mediante microscopía de fluorescencia, siendo particularmente útil para identificar alteraciones cromosómicas como monosomías, trisomías, translocaciones y otras anomalías genéticas. Esta técnica es un complemento valioso para los métodos citogenéticos convencionales, ya que proporciona información detallada en casos de cariotipos normales o complejos. Por otro lado, la CISH emplea sondas marcadas con enzimas que catalizan la formación de un precipitado de color visible bajo microscopía de luz convencional, lo que facilita la observación de las secuencias objetivo sin la necesidad de equipamiento especializado para la detección de fluorescencia.

Protocolo Genérico para la Realización de FISH

El protocolo estándar para la realización de FISH incluye varias etapas clave: hibridación, lavados de poshibridación, contratinción y visualización. Durante la hibridación, la sonda marcada se aplica sobre la muestra y se desnaturaliza el ADN para facilitar la unión de la sonda a su secuencia complementaria. Después de la incubación, se realizan lavados para eliminar el exceso de sonda y se procede a la contratinción, comúnmente con diamidino-2-fenilindol (DAPI), que tiñe los núcleos de un color azul visible bajo luz ultravioleta. La visualización se efectúa con un microscopio de fluorescencia, donde las secuencias diana marcadas se identifican en contraste con los cromosomas o núcleos teñidos. La interpretación de los resultados se basa en el tipo de sonda utilizada y la naturaleza de la alteración cromosómica que se investiga, proporcionando información crítica para el diagnóstico y la investigación genética.