Elettroforesi e analisi delle molecole biologiche
L'elettroforesi è una tecnica essenziale per la separazione delle proteine e l'analisi del DNA. Questo metodo sfrutta tamponi specifici e gel di acrilammide per distinguere le molecole in base a peso molecolare e punto isoelettrico, utilizzando marker e inibitori per una calibrazione e protezione accurate del campione.
Mostra di piùCalcolo della banda e scelta dei marker per l'elettroforesi
Il calcolo della banda in un'analisi elettroforetica è fondamentale per determinare il peso molecolare del campione analizzato. Per esempio, nel caso di frammenti di DNA di 500 paia di basi, si sceglierà un marker di dimensioni corrispondenti per garantire una calibrazione accurata. Per le proteine, si utilizza una scala di proteine standard con pesi molecolari noti. I marker possono essere fluorescenti o colorati con coloranti che permettono la visualizzazione durante o dopo l'elettroforesi. La scelta del marker adeguato è cruciale e deve essere allineata con gli obiettivi dell'esperimento, come la risoluzione di bande di dimensioni simili o la conferma dell'integrità del campione.Preparazione del campione e utilizzo di inibitori
La preparazione del campione per l'elettroforesi richiede attenzione per preservare l'integrità delle molecole di interesse. I metodi chimici di lisi cellulare includono l'uso di detergenti come il Triton X-100 o SDS, mentre i metodi fisici possono comprendere l'omogeneizzazione meccanica dei tessuti. È essenziale l'impiego di inibitori di proteasi e fosfatasi per prevenire la degradazione delle proteine e la perdita di gruppi fosfato, specialmente quando lo scopo dell'analisi è lo studio delle modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione.Tamponi e loro ruolo nell'elettroforesi
I tamponi sono elementi chiave nell'elettroforesi, con funzioni specifiche: il tampone di caricamento aumenta la densità del campione e può contenere coloranti tracciatori come il blu di bromofenolo per monitorare il progresso dell'elettroforesi. Il tampone di corsa mantiene il pH ottimale per la separazione delle molecole e può essere formulato per condizioni riducenti o non riducenti, denaturanti o non denaturanti, a seconda delle necessità sperimentali. La scelta del tampone giusto è fondamentale per ottenere una separazione efficace e riproducibile.Preparazione del gel di acrilamide e tamponi di corsa
La preparazione del gel di poliacrilammide richiede un rapporto preciso tra acrilamide e bis-acrilamide per ottenere la porosità desiderata. I tamponi come il Tris-HCl e la Tris-glicina sono utilizzati per mantenere un pH stabile durante l'elettroforesi. Il tampone di corsa, con un pH di circa 8.8, è essenziale per la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare. La concentrazione del tampone differisce tra lo stacking gel e il running gel, influenzando il pH e la migrazione delle proteine attraverso il gel.Separazione delle proteine per punto isoelettrico
La separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico (pI) può essere realizzata mediante l'uso di anfoliti o di gel di poliacrilammide contenenti derivati chimici (immobilized pH gradient, IPG). Gli anfoliti sono composti anfoteri che formano un gradiente di pH nel gel, mentre gli IPG sono strisce preformate che vengono reidratate prima dell'uso. La reidratazione può avvenire attraverso metodi attivi, passivi o con la tecnica del cup loading, a seconda delle specifiche esigenze sperimentali.Elettroforesi bidimensionale e analisi comparativa
L'elettroforesi bidimensionale (2-DE) consente una separazione delle proteine prima in base al pI e successivamente in base al peso molecolare. Questa tecnica aumenta la risoluzione e permette analisi comparative dettagliate, come lo studio di differenze proteomiche tra campioni patologici e controlli sani. Le proteine separate possono essere ulteriormente identificate e caratterizzate mediante spettrometria di massa, fornendo informazioni preziose sulla loro funzione e sulle possibili alterazioni patologiche.Esercitazioni e applicazioni pratiche
Durante le esercitazioni pratiche, gli studenti imparano a selezionare il tampone più adatto per la separazione delle proteine, a utilizzare agenti riducenti per analizzare la presenza di ponti disolfuro e a confrontare l'elettroforesi nativa con la SDS-PAGE. Si discute anche l'importanza della corretta diluizione dei tamponi elettroforetici e l'uso di sistemi tampone alternativi per la separazione di proteine di grande dimensione, fornendo una comprensione approfondita delle tecniche elettroforetiche e delle loro applicazioni.Vuoi creare mappe dal tuo materiale?
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1
Nell'analisi elettroforetica, calcolare la ______ è essenziale per stabilire il ______ ______ del campione.
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2
Per calibrare correttamente frammenti di DNA di ______ paia di basi, si utilizza un marker di ______ corrispondenti.
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3
Per le ______ si adopera una scala standard con pesi ______ noti.
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4
I marker possono essere resi visibili tramite sostanze ______ o ______ durante o dopo l'elettroforesi.
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5
Metodi chimici di lisi cellulare
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6
Metodi fisici di lisi cellulare
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7
Inibitori di proteasi e fosfatasi
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8
Il blu di ______ è un colorante tracciatore usato per monitorare il ______ dell'elettroforesi.
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9
Il tampone di ______ ha il compito di mantenere il pH ideale per la ______ delle molecole.
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A seconda delle necessità sperimentali, il tampone può essere formulato per condizioni ______ o ______, denaturanti o non denaturanti.
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La scelta adeguata del tampone è cruciale per garantire una separazione ______ e ______.
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efficace riproducibile
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Funzione dei tamponi Tris-HCl e Tris-glicina
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Mantengono pH stabile durante elettroforesi.
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pH del tampone di corsa
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Circa 8.8, essenziale per separazione proteine per peso molecolare.
14
Differenza concentrazione tampone tra stacking e running gel
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Influenza pH e migrazione proteine, ottimizza separazione.
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I gel di poliacrilammide utilizzati per la separazione delle proteine contengono ______ per creare un gradiente di pH.
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derivati chimici
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Gli ______ sono sostanze che possono formare un gradiente di pH all'interno di un gel.
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anfoliti
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Le strisce di ______ vengono reidratate prima di essere usate per la separazione delle proteine.
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La reidratazione delle strisce IPG può essere effettuata tramite metodi ______, ______ o con la tecnica del ______.
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Separazione proteine: primo passaggio
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20
Separazione proteine: secondo passaggio
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21
Identificazione proteine dopo 2-DE
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22
Durante le ______ pratiche, gli studenti imparano a selezionare il ______ adatto per la separazione delle proteine.
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23
Gli studenti apprendono l'uso di agenti ______ per identificare la presenza di ______ disolfuro durante le esercitazioni.
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24
Si confronta l'elettroforesi ______ con la ______ per analizzare le proteine.
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25
Si discute l'importanza della corretta ______ dei tamponi elettroforetici e l'uso di sistemi tampone ______ per proteine di grande dimensione.
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