Principi e Tecniche del Clonaggio Genico

Principi e Tecniche del Clonaggio Genico

Il clonaggio genico è una metodologia fondamentale della biologia molecolare che permette di copiare e moltiplicare specifici segmenti di DNA all'interno di un organismo ospite. Il processo inizia con l'isolamento del frammento di DNA di interesse, che viene poi tagliato in maniera precisa da enzimi di restrizione. Questi enzimi riconoscono sequenze specifiche nel DNA e lo tagliano in corrispondenza di tali siti, generando estremità coesive o "sticky ends" che facilitano l'inserimento del DNA in un vettore di clonaggio. I vettori di clonaggio, come i plasmidi, sono strutture di DNA autonomamente replicabili che possono essere introdotte in cellule ospiti, tipicamente batteriche. Per essere funzionali, i vettori devono avere un'origine di replicazione, che consente la loro duplicazione all'interno dell'ospite, un sito multiplo di clonaggio (MCS) per l'inserimento del DNA estraneo, e un marcatore di selezione, come un gene che conferisce resistenza agli antibiotici, per identificare e selezionare le cellule trasformate che hanno acquisito il vettore con il DNA di interesse. Un esempio classico di vettore plasmidico è il pBR322, che contiene i geni per la resistenza all'ampicillina (ampR) e alla tetraciclina (tetR), utilizzati per la selezione delle cellule trasformate.

Procedura di Clonaggio di un Gene: Dall'Isolamento all'Espressione

Il clonaggio di un gene inizia con l'isolamento del DNA contenente il gene di interesse, seguito dal suo taglio con enzimi di restrizione specifici. Il DNA vettoriale viene tagliato con gli stessi enzimi per generare estremità compatibili. Successivamente, il DNA di interesse e il vettore lineare vengono uniti attraverso il processo di ligazione, mediato da un altro enzima, la DNA ligasi. La costruzione del DNA ricombinante così ottenuta viene poi introdotta in cellule ospiti mediante trasformazione, un processo in cui le cellule acquisiscono DNA estraneo. Dopo la trasformazione, le cellule ospiti vengono coltivate in un mezzo selettivo che permette la crescita solo di quelle che hanno incorporato il vettore con il gene di interesse, grazie alla presenza del marcatore di selezione. Infine, il gene clonato può essere espresso per produrre la proteina corrispondente, che può essere poi isolata e purificata per ulteriori studi o applicazioni. Questo processo è cruciale per la produzione di proteine ricombinanti, la ricerca genetica, e lo sviluppo di terapie basate su geni e vaccini.