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Gli enzimi di restrizione e la DNA ligasi sono fondamentali nel clonaggio del DNA, permettendo il taglio e l'unione di sequenze specifiche. I plasmidi, i BAC e i YAC sono vettori chiave per l'inserimento di DNA in cellule ospiti, mentre la PCR amplifica il DNA per ulteriori analisi. Queste tecniche sono essenziali per la biologia molecolare e la genetica.
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Gli enzimi di restrizione riconoscono e tagliano specifiche sequenze di nucleotidi all'interno del DNA
EcoRI
L'enzima EcoRI riconosce la sequenza palindromica GAATTC e introduce un taglio preciso tra guanina e adenina adiacenti
Gli enzimi di restrizione sono essenziali nel clonaggio del DNA poiché permettono di generare estremità coesive che facilitano l'annessione del DNA tagliato con altri frammenti
I vettori di clonaggio più comunemente utilizzati sono i plasmidi, i cromosomi artificiali batterici (BAC) e i cromosomi artificiali di lievito (YAC)
Origine di replicazione
L'origine di replicazione permette la moltiplicazione del vettore all'interno della cellula ospite
Geni di resistenza agli antibiotici
I geni di resistenza agli antibiotici sono utilizzati come marcatori di selezione per identificare le cellule ospiti che hanno incorporato il vettore di clonaggio
Sito multiplo di clonaggio o polylinker
Il sito multiplo di clonaggio contiene diversi siti di taglio per gli enzimi di restrizione, permettendo l'inserimento di diversi frammenti di DNA
I plasmidi hanno una capacità di clonazione limitata, mentre i BAC e i YAC possono accogliere frammenti di DNA più grandi
Il frammento di DNA di interesse viene isolato mediante digestione con enzimi di restrizione e successiva separazione mediante elettroforesi su gel
Il DNA viene inserito nel vettore di clonaggio mediante l'enzima DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami fosfodiestere tra i nucleotidi terminali
Il vettore ricombinante viene introdotto nelle cellule ospiti mediante trasformazione, microiniezione o biolistica
Le librerie genomiche sono raccolte di cloni batterici contenenti vari frammenti del genoma di un organismo e sono utilizzate per isolare e clonare geni specifici
La reazione a catena della polimerasi (PCR) permette l'amplificazione selettiva di specifiche sequenze di DNA, rivoluzionando la biologia molecolare
00
EcoRI - Sequenza riconosciuta
Riconosce la sequenza palindromica GAATTC e taglia tra G e A.
01
Estremità coesive ('sticky ends')
Sono le terminazioni appiccicose del DNA tagliato che facilitano l'unione con frammenti complementari.
02
Elettroforesi su gel
Tecnica per separare e visualizzare frammenti di DNA in base alla lunghezza.
